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Lactobacillus casei matado por calor confiere una amplia protección contra la infección primaria por

Las bacterias del ácido láctico (LAB) son los probióticos comunes. Aquí, investigamos los efectos protectores antivirales de la cepa LAB matada por calor Lactobacillus casei DK128 (DK128) en los virus de la gripe. El tratamiento intranasal de ratones con DK128 confirió protección contra diferentes subtipos de virus de la gripe al disminuir la pérdida de peso y disminuir las cargas virales. La protección mediante DK128 matado por calor se correlacionó con un aumento en las células de macrófagos alveolares en los pulmones y las vías respiratorias, la inducción temprana de anticuerpos específicos de virus, niveles reducidos de citocinas proinflamatorias y células inmunes innatas. Es importante destacar que los ratones que estaban protegidos contra la infección viral primaria como resultado del pretratamiento con DK128 matado por calor desarrollaron una inmunidad heterosubtípica posterior contra la infección por el virus secundario. Para la protección contra el virus de la gripe mediante el pretratamiento con DK128 matado por calor, se requirieron células B y células T CD4 parcialmente, pero no células T CD8, como se infiere de los estudios que utilizan modelos de ratones knockout. Nuestro estudio proporciona información sobre cómo los huéspedes pueden equiparse con inmunidad innata y adaptativa a través del tratamiento DK128 matado por calor para proteger contra el virus de la gripe, apoyando que el LAB matado por calor se pueda desarrollar como probióticos antivirus.


El virus de la influenza puede causar enfermedades respiratorias graves en humanos. A pesar de la disponibilidad de vacunas contra la influenza, se estima que las infecciones por el virus de la influenza causan de 3 a 5 millones de enfermedades graves y de 250,000 a 500,000 muertes relacionadas con la influenza en todo el mundo durante las epidemias1,2,3. Las vacunas actuales contra la influenza son efectivas cuando las cepas de las vacunas coinciden bien con los virus de influenza circulantes. Un brote reciente del nuevo virus pandémico H1N1 2009 representa un ejemplo de la eficacia limitada de la vacunación actual4,5. El virus de la influenza A infecta a varios huéspedes, incluidos humanos, aves y cerdos. Una variedad de virus de influenza A están presentes en muchos subtipos diferentes basados ​​en proteínas de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) en la superficie del virus. En la actualidad, se identifican 18 subtipos diferentes de HA (H1-H18) y 11 moléculas de subtipo NA (N1-N11) diferentes, lo que indica la existencia de numerosas combinaciones de virus de influenza HA y NA6. Por lo tanto, es importante encontrar una medida alternativa que brinde protección contra el virus de la influenza independientemente de la especificidad de la cepa. Las bacterias del ácido láctico (LAB) son los probióticos más comunes que otorgan beneficios para la salud del huésped como microorganismos. Diversas verduras fermentadas y productos lácteos contienen una variedad de LAB, que mostraron beneficios para la salud1,7,8,9,10.


Se informó que algunas cepas de LAB como probióticos protegen parcialmente contra enfermedades infecciosas bacterianas, como Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae 11,12. Además, se demostró que una variedad de cepas LAB protegen a los ratones contra las infecciones por el virus de la influenza al mejorar las tasas de supervivencia después del pretratamiento intranasal u oral, pero no previenen enfermedades graves de pérdida de peso13,14. Se demostró que el yogur fermentado con Lactobacillus reduce los casos de resfriado en ancianos sanos15 y prolonga los períodos de supervivencia de los ratones con infección por el virus de la influenza16. En particular, estudios previos han demostrado los efectos protectores contra la infección por el virus de la influenza mediante la administración de varias cepas de LAB a través de la ruta oral3,17,18,19,20 o la ruta intranasal14,20,21,22,23,24. Sin embargo, en los estudios previos, los efectos probióticos de LAB sobre la infección por el virus de la influenza incluyen protección parcial o períodos de supervivencia prolongados, que acompañan a una pérdida de peso sustancial y dan como resultado una eficacia diferente según las cepas y las rutas de LAB.


Se desconoce si los pretratamientos con LAB matado por calor pueden conferir protección al prevenir la pérdida de peso de los animales después de la infección por el virus de la influenza y, por lo tanto, mejorar la morbilidad. Además, los mecanismos de protección antivirales de LAB son poco conocidos. En el presente estudio, encontramos que el tratamiento de ratones con cepa Lactobacillus casei cepa DK128 con muerte por calor confirió una protección no específica de la cepa contra la morbilidad de la pérdida de peso y la mortalidad debido a la infección letal por el virus de la influenza. Se descubrió que la protección permisiva contra la infección viral primaria a través de pretratamientos DK128 matados por calor equipaba a los ratones con inmunidad de protección cruzada contra la infección letal secundaria con un virus heterosubtípico. Se investigaron los posibles mecanismos subyacentes de los efectos antivirales de DK128.


Los pretratamientos intranasales con DK128 matado por calor confieren protección contra el virus de la gripe H3N2

En nuestro estudio anterior, hemos informado que los pretratamientos intranasales con Lactobacillus plantarum DK119 vivos podrían desarrollar resistencia a la infección por el virus de la gripe H1N1 en ratones a pesar de un cierto grado de morbilidad20. Se sugirió que LAB DK128, un nuevo aislado de vegetales fermentados, era un probiótico prometedor25. Para determinar si los pretratamientos con LAB matado por calor dotan a los ratones de resistencia al virus de la influenza, los ratones tratados con DK128 simulados y matados por calor (BALB / c) se infectaron con una dosis letal del virus A / Filipinas / 82 (H3N2) Los ratones BALB / c que fueron tratados con DK128 matado por calor a una dosis baja, 1 × 107 CFU o 1 × 108 CFU mostraron una pérdida de peso de aproximadamente 12% a 10% pero todos sobrevivieron a la infección letal con H3N2 virus. En contraste, los ratones tratados con DK128 matado por calor a una dosis más alta (1 × 109 UFC) antes de la infección no mostraron pérdida de peso, mientras que los ratones tratados con simulación mostraron una pérdida de peso severa que alcanzó el punto final al día 8–9 después de la infección y todos murieron. Por lo tanto, la eficacia de la protección contra el virus de la gripe a través de DK128 matado por calor parecía depender de las dosis de pretratamiento de LAB. Estos resultados son muy significativos porque los ratones con pretratamientos DK128 muertos por calor pueden protegerse contra la infección por el virus de la influenza letal, lo que resulta en un 100% de supervivencia y en la prevención de la pérdida de peso.


Los ratones con pretratamiento con DK128 matado por calor controlan las cargas virales pulmonares y las citocinas proinflamatorias inducidas por virus a niveles más bajos

En un conjunto independiente de experimentos, determinamos la eficacia de eliminar las cargas virales pulmonares, que es un parámetro importante para evaluar la eficacia protectora. A los 7 días después de la infección, se sacrificaron los ratones y se diluyeron las muestras de extracto de pulmón para determinar los títulos infecciosos de huevo . Los ratones tratados con DK128 (109 UFC) matados por calor mostraron niveles de títulos virales aproximadamente 18 veces más bajos que los de los ratones tratados con simulación después de la infección. La infección con un virus de influenza patógena puede causar una producción excesiva de citocinas proinflamatorias. Las citocinas inflamatorias IL-6 y TNF-α se determinaron en BALF y muestras de pulmón. A los 7 días después de la infección, se detectó IL-6 a niveles significativamente más bajos en BALF y muestras de pulmón de ratones pretratados con DK128 matados por calor que aquellos en ratones tratados simuladamente después de la infección. TNF-α también fue significativamente menor en BALF de ratones pretratados con DK128 matados por calor en comparación con ratones sin tratamiento previo a pesar de que no hubo diferencia estadística en los niveles de TNF-α pulmonar entre los dos grupos. Por lo tanto, la inducción de citocinas proinflamatorias debido a una infección viral se redujo sustancialmente como resultado del tratamiento con DK128 matado por calor.


El reclutamiento de células inmunes innatas inducidas por virus se modula de forma diferencial mediante el pretratamiento con DK128 destruido por calor.

El virus de la influenza patógena puede causar una enfermedad inflamatoria grave en las vías respiratorias inferiores y los pulmones. Por lo tanto, el análisis de las poblaciones de células inmunes reclutadas en el sitio de la infección por el virus proporcionaría información sobre los posibles mecanismos de protección mediados por el pretratamiento con DK128 destruido por calor. A los 7 días de la infección con el virus letal A / Filipinas (H3N2), recolectamos muestras de pulmón y BALF para analizar fenotipos de células inmunes mediante citometría de flujo multicolor. Se observaron células fenotípicas de macrófagos alveolares (CD11C + CD11b-F4 / 80 +) a niveles más altos en BALF de ratones con pretratamiento con DK128 matado por calor que en ratones tratados con simulación con pérdida de peso severa.

Por el contrario, las muestras de BALF y pulmón de ratones con pretratamiento DK128 matado por calor mostraron niveles más bajos de monocitos (F4 / 80 + CD11c − CD11b + Ly6ChiSiglecF−), células asesinas naturales (F4 / 80 − DX5 + CD69 +) y asesino natural activado células (F4 / 80 − DX5 + CD69 +) (Fig. 3b – d, f – h), mientras que los ratones no tratados sin tratamiento previo mostraron un reclutamiento significativamente mejorado de monocitos, células asesinas naturales y células asesinas naturales activadas en respuesta a la infección letal con Virus A / Filipinas (H3N2) (Fig. 3b – d, f – h). El análisis celular de BALF y pulmones sugiere que la modulación mediada por LAB DK128 de células inmunes innatas puede prevenir la inflamación pulmonar, contribuyendo a la protección contra la infección por el virus de la influenza.


Para detallar aún más el posible papel de los macrófagos alveolares, aplicamos clodronato-liposoma para agotar los macrófagos de las vías respiratorias en ratones con tratamiento LAB matado por calor antes de la infección letal por el virus de la influenza (Figura complementaria 1). Confirmamos que más del 90% de los macrófagos alveolares se agotaron en los pulmones después del tratamiento con clodronato-liposoma antes de la infección por el virus de la influenza (Figura complementaria 1a). Tras la infección letal con el virus de la gripe, los ratones LAB DK128 tratados con clodronato mostraron una pérdida de peso severa de más del 20% y una tasa de supervivencia del 25%, mientras que los ratones LAB DK128 de control (100%) sobrevivieron a la infección letal y evitaron la pérdida de peso (DK.H3N2, Suplementario Fig. 1b, c). Todos los ratones sin tratamiento LAB con muerte por calor murieron de infección (datos no mostrados). Estos datos indican las funciones protectoras de los macrófagos alveolares que fueron elevados por el tratamiento previo con LAB matado por calor.


El pretratamiento de ratones con DK128 matado por calor media la inducción temprana de anticuerpos específicos de virus tras la infección

Las células B son responsables de producir anticuerpos que juegan un papel crítico en el establecimiento de una inmunidad adaptativa de larga duración. Para comprender mejor las posibles funciones de los anticuerpos para conferir protección en los ratones pretratados con DK128 matados por calor, comparamos las respuestas de anticuerpos específicos del virus en ratones BALB / c tratados con DK128 (108 UFC) matados por calor a los 6 días de la infección con dosis baja (1.5 x LD50) del virus H3N2 . Los ratones pretratados con DK128 matados por calor mostraron un nivel moderado de pérdida de peso (6–9%), mientras que los ratones de control simulado exhibieron una pérdida de peso severa (20–25%) que resultó en tasas de supervivencia parcial tras la infección por el virus H3N2. Curiosamente, los ratones con pretratamiento con DK128 matado por calor elevaron niveles significativamente más altos de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a en un momento anterior del día 6 después de la infección en comparación con aquellos en ratones simulados no tratados con infección. En un momento posterior de 14 días después de la infección, los ratones sin tratar infectados con el virus H3N2 que mostraron una pérdida de peso severa alcanzaron los altos niveles de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a comparables a los de los ratones tratados con DK128 matados por calor. Estos resultados sugieren que los ratones con pretratamiento DK128 matado por calor son efectivos para inducir anticuerpos IgG tempranos, posiblemente contribuyendo a controlar la replicación viral, así como a reducir la pérdida de peso, mientras que los ratones no tratados son ineficaces para producir anticuerpos IgG en los primeros tiempos después de la infección, lo que resulta en un alto replicación viral y pérdida de peso severa, y es probable que muera.


Los ratones BALB / c protegidos contra la infección primaria del virus H3N2 por el pretratamiento con DK128 matado por calor adquieren inmunidad heterosubtípica contra la infección secundaria más tarde

Es altamente deseable que los huéspedes adquieran inmunidad contra las infecciones virales heterosubtípicas primarias y secundarias sin morbilidad (pérdida de peso). Para determinar la inmunidad de protección cruzada contra la infección secundaria posterior, los ratones BALB / c que estaban protegidos contra la infección primaria por el virus H3N2 como resultado del pretratamiento con DK128 matado por calor fueron desafiados letalmente con H1N1 heterosubtípico (A / California / 2009) virus pandémico a las 4 semanas. Los ratones sin tratamiento previo mostraron una pérdida de peso superior al 20% y tasas de supervivencia del 0% después de la infección con el virus pandémico H1N1. Los ratones que estaban protegidos contra la infección primaria por el virus H3N2 A / Filipinas / 2/1982 como resultado del pretratamiento con DK128 matado por calor mostraron solo una pérdida de peso transitoria del 2–5% y una protección del 100% después de la infección secundaria con el virus heterosubtípico H1N1.


Para comprender mejor los posibles correlatos inmunes que confieren protección contra la infección secundaria, se realizó un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) para determinar los anticuerpos HA cruzados protectores. De acuerdo con los niveles de anticuerpos IgG (Fig. 4), los sueros de ratones sobrevivieron a la infección primaria H3N2, independientemente del tratamiento LAB, mostraron altos títulos de actividad de HI contra el virus H3N2 homólogo (Fig. 2a suplementaria). Curiosamente, los sueros de ratones que estaban protegidos contra la infección por H3N2 a través de un tratamiento LAB previo mostraron niveles sustanciales de actividad de HI contra el virus H1N1 heterosubtípico a un nivel 2 veces mayor en comparación con los sueros de ratones que sobrevivieron a la infección por H3N2 sin tratamiento previo de LAB (Figura complementaria 2b ) Por lo tanto, los ratones que estaban protegidos de la infección primaria (H3N2) mediante el pretratamiento con DK128 matado por calor han adquirido inmunidad heterosubtípica contra la infección heterosubtípica secundaria (H1N1), muy probablemente debido a las elevadas respuestas inmunes del huésped durante la infección primaria.


Los ratones C57BL / 6 con pretratamiento DK128 matado por calor adquieren inmunidad contra el virus primario H1N1 y el virus secundario rgH5N1

Es altamente deseable si los efectos protectores del tratamiento con LAB matado por calor se esperaran en un patrón de cepa no específico. Probamos si el pretratamiento con DK128 matado por calor mediaría la protección contra un subtipo diferente de virus de influenza en una cepa de ratón diferente. Los ratones C57BL / 6 (n = 5) se trataron con DK128 matado por calor (1 x 109 UFC) en los días -4 y -1 antes de la infección con el virus H1N1 (A / California / 2009). Como observamos con ratones BALB / c, los ratones C57BL / 6 tratados con DK128 matados por calor mostraron protección contra la infección letal por el virus H1N1 con una pérdida de peso mínima de aproximadamente 5%. En contraste, el grupo de control simulado no sobrevivió a la infección viral y todos murieron el día 9 después de la infección (Fig. 6a, d). Además, determinamos si los ratones C57BL / 6 tratados con DK128 muertos con calor que estaban protegidos contra la infección primaria del virus H1N1 sin pérdida de peso también estarían protegidos contra la infección secundaria con el virus rgH5N1 Los ratones C57BL / 6 que estaban protegidos contra el virus H1N1 primario mediante el pretratamiento con DK128 matado por calor estaban completamente protegidos contra la infección letal con el virus secundario rgH5N1 que era letal para todos los ratones sin tratamiento previo. Estos resultados sugieren que el pretratamiento con DK128 matado por calor puede equipar a los ratones con la capacidad de conferir inmunidad protectora contra una gama más amplia de infecciones primarias y secundarias del virus de la influenza A. Los sueros de ratones que sobrevivieron a la infección primaria H1N1 mostraron altos títulos de actividad de HI contra el virus H1N1 homólogo, así como niveles significativos de actividad de HI contra el virus rgH5N1 heterosubtípico, que son más altos que los del control de suero sin tratamiento previo . Además, los sueros de infección por H1N1 mostraron anticuerpos de unión de reacción cruzada contra el virus rgH5N1 (datos no mostrados). Por lo tanto, las respuestas inmunitarias de reacción cruzada desarrolladas durante la infección primaria parecen ser parcialmente responsables de conferir protección contra la infección secundaria.


Se requieren células B para establecer la inmunidad protectora en ratones con tratamiento con DK128 matado por calor

Observamos que los ratones pretratados con DK128 matados por calor provocaron una inducción más temprana de anticuerpos con cambio de isotipo IgG específicos para el virus infeccioso, lo que indica las funciones importantes de las células B. Utilizando un modelo de ratón deficiente en células B (µMT), determinamos además si las células B desempeñarían un papel crítico en el establecimiento de la inmunidad protectora contra la infección por el virus de la gripe a través de pretratamientos DK128 destruidos por calor. Los ratones deficientes en células B (µMT) (n = 5) se trataron con DK128 (109 UFC por ratón) matado por calor el día 4 y el día 1 antes de la infección con el virus pandémico H1N1. En comparación con los ratones µMT tratados con simulación después de la infección, los ratones µMT pretratados con DK128 matados por calor mostraron un retraso de 3 a 5 días en mostrar una pérdida de peso severa . A pesar de un retraso prolongado en la pérdida de peso, se consideró que los ratones µMT tratados con DK128 matados por calor tenían una morbilidad progresiva y no sobrevivieron a la infección por el virus H1N1. Estos resultados sugieren que las células B son esenciales para establecer una protección sostenida y duradera, aunque un retraso significativo en la pérdida de peso podría deberse a la inmunidad innata mediada por el pretratamiento DK128.


Las células T no son necesarias para la protección contra la infección primaria por el pretratamiento con DK128 matado por calor, pero las células T CD4 contribuyen en parte a prevenir la pérdida de peso severa

A diferencia de los ratones con deficiencia de células B, los ratones con deficiencia de células T CD8 (CD8KO) que recibieron pretratamiento con DK128 matado por calor mostraron una protección completa contra la infección primaria del virus H1N1 sin pérdida de peso . Los ratones deficientes en células T CD4 (CD4KO) que fueron pretratados con DK128 matado por calor fueron protegidos contra la infección primaria por el virus H1N1, mostrando una pérdida de peso corporal de aproximadamente el 8% y todos los ratones CD4KO (100%) sobrevivieron a la infección letal Sin embargo, todos los ratones murieron el día 9 después de la infección en los grupos CD4KO y CD8KO de control simulado no tratados.


Los LAB como probióticos se han estudiado principalmente con bacterias vivas que mejoran las tasas de supervivencia o la protección parcial contra el virus de la influenza. En el presente estudio, investigamos los efectos del LAB DK128 matado por calor sobre la eficacia protectora contra las infecciones primarias y secundarias del virus de la influenza heterólogo, y la modulación de las células inmunes innatas después de la infección. Descubrimos que los ratones que fueron pretratados con DK128 matado por calor estaban bien protegidos contra la infección por el virus de la influenza letal independientemente de la especificidad de la cepa al disminuir la pérdida de peso. Los ratones que fueron tratados con DK128 con muerte por calor y protegidos contra la infección primaria por el virus de la influenza desarrollaron inmunidad que contribuye a la protección cruzada heterosubtípica contra la infección secundaria posterior con el virus heterosubtípico. Además, se requirieron células B pero no células T para establecer inmunidad prolongada que confiere protección mediante pretratamiento con DK128 destruido por calor. Estos hallazgos mejorarían significativamente nuestra comprensión de los mecanismos por los cuales los huéspedes pueden desarrollar inmunidad innata y adaptativa contra las infecciones virales letales. Sugiere un uso potencial de LAB como probióticos antivirales.


En general, se espera que los huéspedes que experimentaron y sobrevivieron a una enfermedad grave debido a una infección viral natural desarrollen una inmunidad fuerte después de la recuperación. En este estudio, los ratones tratados con DK128 matados por calor sin experimentar una enfermedad grave durante la infección viral primaria pueden desarrollar una fuerte inmunidad. Es significativo que los ratones DK128 pretratados con calor y bien protegidos contra la infección primaria también desarrollaran inmunidad de protección cruzada contra el virus heterosubtípico secundario. La inducción rápida de anticuerpos con cambio de isotipo IgG podría ser un mecanismo clave para equipar a los huéspedes con inmunidad temprana contra los patógenos. Este estudio sugiere que los ratones tratados con DK128 matados por calor pueden inducir anticuerpos IgG1 e IgG2a en un momento anterior y a niveles más altos sin mostrar signos de enfermedad grave, como la pérdida de peso corporal, en comparación con los ratones tratados simuladamente después de una infección letal. La vacunación contra los virus de la influenza estacional generalmente induce respuestas inmunes específicas de la cepa a las cepas vacunales26, mientras que la infección por el virus de la influenza induce respuestas inmunes de reacción cruzada y duraderas más amplias cuando el huésped es reinfectado por los mismos subtipos de virus27,28. En este estudio, los ratones con pretratamiento de DK128 matado por calor se protegieron contra infecciones primarias y secundarias por el virus de la influenza secundaria heterosubtípica. Los sueros de ratones protegidos contra el virus H1N1 primario o el virus H3N2 mediante tratamiento LAB matado por calor exhibieron altos niveles de actividad inhibidora de la hemaglutinación homóloga y heterosubtípica durante la infección. Los anticuerpos de reacción cruzada elevados durante la infección primaria probablemente contribuyan a conferir protección heterosubtípica durante las infecciones letales secundarias. En estudios previos, se sabe que los ratones que sobrevivieron a la infección por el virus de la influenza y la enfermedad grave de pérdida de peso inducen respuestas cruzadas de células T protectoras, contribuyendo en parte a la protección heterosubtípica durante las infecciones letales secundarias posteriores29,30. Como se esperaba, los ratones de control sobrevivientes en el grupo PBS.H3N2 recuperados de una pérdida de peso severa fueron protegidos durante la infección secundaria por virus (datos no mostrados).


La importancia de las células B se evidenció aún más por el hallazgo de que los ratones con deficiencia de células B no pudieron establecer una protección duradera. Se observó un retraso en la pérdida de peso probablemente debido a la inducción de inmunidad innata como resultado del pretratamiento con DK128 matado por calor. Los ratones CD8KO con pretratamiento con DK128 matado por calor no mostraron ninguna pérdida de peso, lo que indica que las células T CD8 podrían no desempeñar un papel crítico en conferir protección mediada por el tratamiento con DK128. Mientras tanto, los ratones CD4KO con tratamiento DK128 matado por calor mostraron una pérdida de peso moderada (~ 5-8%) durante la infección primaria y una pérdida de peso sustancial de ~ 15-18% durante la infección secundaria en contraste con los ratones de tipo salvaje o CD8KO. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que las células B están jugando un papel crítico en el establecimiento de la inmunidad mediada por DK128 destruida por calor; y las células T CD4 están parcialmente involucradas en esta protección, probablemente ayudando a las células B a generar inmunidad duradera.


Curiosamente, observamos que los macrófagos alveolares aumentaron en el BALF y se mantuvieron en los pulmones de los ratones tratados con DK128 matados por calor, mientras que los ratones sin tratamiento previo mostraron un nivel significativamente menor de macrófagos en los pulmones después de la infección viral. Una mejor comprensión de la movilización innata de las células inmunes durante el momento temprano de la infección proporciona una pista sobre el mecanismo de protección. Los macrófagos alveolares se encuentran en la interfase entre el aire y el tejido pulmonar, proporcionando la primera línea de defensa inmune innata contra los virus de la gripe. Los macrófagos alveolares parecen jugar un papel crítico en conferir protección mediada por el tratamiento previo con LAB matado por calor. Tras la infección por el virus de la gripe, los macrófagos alveolares se agotaron a niveles más bajos que se correlacionan con la enfermedad y la mortalidad. Se informó que los macrófagos alveolares liberaron citocinas inflamatorias para controlar la replicación viral, pero no admitieron replicaciones virales productivas dentro del tracto respiratorio. Es probable que el aumento de las poblaciones de macrófagos alveolares en BAL de ratones pretratados con DK128 matados por calor después de la infección por el virus H3N2 sea parcialmente responsable de conferir protección, lo que se ve respaldado por los resultados del experimento de agotamiento de macrófagos (Figura complementaria 1). Tras la infección letal con el virus de la gripe, los ratones LAB tratados con clodronato mostraron una pérdida de peso severa de más del 20%. La importancia de los macrófagos alveolares en la protección mediada por LAB contra el virus de la influenza es consistente con un informe de que el agotamiento de macrófagos alveolares mediado por clodronato abolió la protección mediada por LAB en vivo. Otras células inmunes innatas, como los monocitos y las células asesinas naturales activadas, fueron reguladas a un nivel más bajo en las vías respiratorias y los pulmones de los ratones tratados con DK128 con muerte por calor, mientras que los ratones sin tratamiento previo reclutaron altos niveles de estas células inflamatorias tras una infección letal. Además, estudios previos demostraron que los macrófagos alveolares juegan un papel crítico en el control de las cargas virales pulmonares y la protección contra las infecciones por el virus de la influenza. El tratamiento con DK128 matado por calor probablemente modula las células inmunes innatas de manera diferencial dependiendo de los tipos de células en el microambiente pulmonar, lo que puede contribuir a controlar las cargas virales pulmonares y la protección durante la infección primaria por el virus de la influenza.


El LAB vivo se estudia con mayor frecuencia probablemente porque se espera que los Lactobacillus vivos sean más efectivos para mejorar las tasas de supervivencia de los ratones que las bacterias muertas, como lo demuestra la administración oral e intranasal. La eficacia de la protección por LAB es variable en un amplio rango de mejora de la protección de supervivencia a solo retrasar la muerte dependiendo de las cepas de elección. En términos de preocupaciones de seguridad, el LAB matado por calor sería una opción deseable para desarrollar probióticos más seguros. Las células dendríticas son antígenos profesionales que presentan células inmunes innatas que juegan un papel crítico en la generación de inmunidad celular. La inducción de citocinas proinflamatorias se considera un posible mecanismo de los efectos antivirales mediados por LAB, aunque los altos niveles de citocinas inflamatorias causaron enfermedad pulmonar inflamatoria en ratones infectados letalmente con virus de influenza patogénicos. Los protocolos experimentales de LAB son diversos y los períodos de pretratamiento son de pocos días a varias semanas por vía intranasal u oral. En este estudio, encontramos que los ratones que fueron pretratados con DK128 matado por calor estaban protegidos contra la infección letal y protegidos contra la pérdida de peso severa. Incluso un solo tratamiento resultó en una protección efectiva contra la infección letal, así como en la prevención de la pérdida de peso (datos no mostrados). Estos resultados son notables de que la cepa DK128 como una nueva cepa de Lactobacillus probada en este estudio podría tener potentes efectos protectores al equipar a los huéspedes con inmunidad contra el virus de la gripe en una forma de LAB muerta.


Un posible mecanismo de los efectos antivirales de LAB DK128 con muerte por calor es que las células inmunes innatas y las citocinas inducidas por el control de pretratamiento con DK1 con muerte por calor o retrasan la replicación viral a un nivel inferior que no causa enfermedad. Incluso los ratones deficientes en células B con pretratamiento con DK1 matado por calor mostraron un retraso de 3 a 5 días antes de mostrar un signo de pérdida de peso severa y mortalidad. Por lo tanto, el control inmediato de la replicación viral mediante inmunidad innata protectora podría proporcionar tiempo suficiente para que los huéspedes establezcan inmunidad protectora cruzada heterosubtípica a través de las células B. Esta idea está respaldada por los importantes roles de las células T CD4 en el establecimiento de la inmunidad heterosubtípica durante la infección primaria y secundaria, probablemente al proporcionar ayuda a las células B. Además, la inflamación innata moderada inducida por el pretratamiento con DK128 matado por calor puede proporcionar un microambiente favorable para acelerar la inducción más temprana de inmunidad adaptativa. Se requerirán más estudios para probar esta hipótesis.


También se informó que la administración oral de LAB en vivo proporciona efectos beneficiosos para mitigar enfermedades graves debidas a la infección por el virus de la influenza en ratones. Queda por determinar si LAB matado por calor conferiría una protección similar contra el virus de la influenza a través de la dieta diaria. La transmisión aérea del virus de la influenza se propaga rápidamente entre humanos susceptibles, como lo demuestra la pandemia de H1N1 200944. FluMist® tiene licencia para formulaciones de vacunas contra la gripe en aerosol nasal. Nuestro estudio actual proporciona una evidencia de que el LAB matado por calor podría administrarse potencialmente en forma de aerosol nasal como un fármaco profiláctico contra infecciones inespecíficas por el virus de la influenza.






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